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Methoden

Um Gene und insbesondere Zinkfingertranskriptionsfaktoren (ZNFs) zu identifizieren, die eine Rolle in der unterschiedlichen Regulation der Aktivität und des Verhaltens von kortikalen neuralen Stamm- und Vorläuferzellen (cNPCs) zwischen verschiedenen Primatenspezies haben, nutzen wir vielfältige Methoden:

Transkriptomanalysen

Zur Identifizierung von Kandidatengenen verwenden wir einen vergleichenden Transkriptomikansatz, bei dem wir die Transkriptome von cNPCs verschiedener Primatenspezies analysieren und vergleichen. Dabei greifen wir sowohl auf klassische als auch auf Einzelzell-Transkriptomanalysen zurück, die an Gehirnorganoiden und Gewebeproben durchgeführt werden. Unser Ziel ist es, Gene zu finden, die spezifisch in bestimmten Primaten aktiv sind oder nur bei diesen existieren. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf Genen, die ausschließlich im Menschen vorkommen und in anderen nicht-menschlichen Primaten fehlen – sogenannten menschen-spezifischen Genen.

Elektroporation von Gehirnorganoiden

Als Modell, um die Funktion dieser Kandidatengene zu testen, nutzen wir Gehirnorganoide von verschiedenen Primatenspezies, die wir mit einem vereinheitlichten Protokoll herstellen. Diese Kandidatengene werden durch Elektroporation in den Gehirnorganoiden exprimiert (JOVE). Diese Gene werden zuerst in ringförmige DNA-Moleküle, sogenannte Plasmide, eingebaut. Diese Plasmide werden dann in die Flüssigkeits-gefüllten Räume der Gehirnorganoide, die sogenannten Ventrikel-ähnlichen Strukturen, injiziert. Anschließend werden kurze elektrische Pulse appliziert, wodurch die Zellen des Gehirnoragnoids, die Plasmide aufnehmen. Die Gene, die auf den Plasmiden liegen, werden darauf in den Zellen aktiviert und wir können untersuchen, wie sich das Verhalten der Zellen als Antwort auf diese Gene verändert.

Analyse von elektroporierten Gehirnorganoiden

Ein verändertes Verhalten der Vorläuferzellen zeigt sich zum Beispiel in einer veränderten Teilungsaktivität oder in der Produktion anderer Zelltypen (wie verschiedene Vorläuferzellen oder Neuronen). Dieses veränderte Verhalten können wir mithilfe von Immunfluoreszenzfärbungen mit verschiedenen Markern (z.B. Zellteilungs- und neuronalen Markern) nachweisen. Dazu werden die Gehirnorganoide entweder in dünne Schnitte von 20 Mikrometer Dicke geschnitten oder als Ganzes transparent gemacht (sogenanntes Clearing) und anschließend mit Antikörpern gegen die entsprechenden Marker gefärbt. Die gefärbten Organoide oder Organoidschnitte können dann unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert werden. Weitere Methoden, die wir zur Charakterisierung der Zellen verwenden, sind Transkriptomanalysen, quantitative Real-time PCR, Western Blot und andere molekularbiologische Techniken.

Methoden zur Analyse von elektroporierten Gehirnorganoiden