Methodik
Um Gene und insbesondere Zinkfingertranskriptionsfaktoren (ZNFs) zu identifizieren, die eine Rolle in der unterschiedlichen Regulation der Aktivität und des Verhaltens von kortikalen neuralen Stamm- und Vorläuferzellen (cNPCs) zwischen verschiedenen Primatenspezies haben, nutzen wir vielfältige Methoden:
Zur Identifizierung von Kandidatengenen nutzen wir einen vergleichenden Transkriptomikansatz, in welchem wir die Transkriptome von cNPCs verschiedener Primatenspezies miteinander vergleichen.
Als Modell, um die Funktion dieser Kandidatengene zu testen, nutzen wir Gehirnorganoide von verschiedenen Primatenspezies, die wir mit einem vereinheitlichten Protokoll (siehe hier) herstellen.
Diese Kandidatengene werden durch Elektroporation in den Gehirnorganoiden exprimiert. Dabei werden Expressionskonstrukte durch kurze elektrische Pulse in die Zellen transfiziert.
Kandidatengene, die in den Elektroporationsexperimenten zu einer Veränderung des Verhaltens und der Aktivität der cNPCs führen, werden in Knock-Out (KO) Studien mithilfe von CRISPR/Cas9 genauer analysiert.
Elektroporierte und KO Gehirnorganoide werden mit Immunfluoreszenzfärbungen und konfokaler Mikroskopie analysiert. Je nach Fragestellung kommen auch molekularbiologische Methoden, wie Western Blot und quantitative real-time PCR zum Einsatz.
Zusätzlich zu diesen etablierten Methoden entwickeln wir unsere Gehirnorganoidprotokolle (z.B. zur Generierung vaskularisierter Organoide) und Analyseprotokolle (z.B. zur 3D Rekonstruktion von Organoiden durch „Optical Clearing“) weiter.